Miguel Ángel Mosqueda-Cabrera *, Diana Laura Desentis-Pérez y Tania Araceli Padilla-Bejarano
a Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Departamento de Biología de la Conservación, Carretera Tijuana-Ensenada # 3918, Zona Playitas, 22860 Ensenada, Baja California, Mexico
b Universidad Autónoma de Baja California, Facultad de Ciencias, Carretera Transpeninsular # 3917, Colonia Playitas, 22860 Ensenada, Baja California, Mexico
*Corresponding author: arteaga@cicese.mx (M.C. Arteaga)
Received: 28 February 2024; accepted: 01 July 2024
Resumen
Las larvas de tercer estadio avanzado (AdvL3) de Gnathostoma sp. I aisladas de la musculatura de Dormitator latifrons y Rhamdia guatemalensis son morfológica y molecularmente iguales entre sí y se relacionan genéticamente con un juvenil aislado del hígado de Didelphis marsupialis, en la cuenca del río Ostuta, Oaxaca. Asimismo, son diferentes de las 3 especies de Gnathostoma descritas para México por el tamaño del cuerpo, por los ganchos del bulbo cefálico en la fase AdvL3 y por la presencia de un prepucio cuticular en el extremo posterior de un macho juvenil. A través del marcador molecular COI, un análisis de distancias genéticas y la inferencia de la filogenia entre las especies del género, se concluye que Gnathostoma sp. I está estrechamente emparentada, pero taxonómicamente es diferente a G. turgidum y a las otras especies presentes en México y el mundo, aun cuando falta material para establecerla como especie nueva. Por otro lado, con base en características morfológicas se documenta el hallazgo de las AdvL3 de G. lamothei (en Rhambdia guatemalensis y Lontra longicaudis) y la AdvL3 de otra especie no identificada (en R. guatemalensis y Synbranchus marmoratus), pero distinta a las anteriores de acuerdo con evidencias morfológicas y moleculares.
Palabras clave: Gnathostoma spp.; Tercer estadio avanzado; Filogenia; México; Marsupiales
© 2025 Universidad Nacional Autónoma de México, Instituto de Biología. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
The high morphological variation found in the immature stages of the nematode Gnathostoma sp. I is not supported by molecular information
Abstract
The third-stage advanced larvae (AdvL3) of Gnathostoma sp. I isolated from the musculature of Dormitator latifrons and Rhamdia guatemalensis are identical to each other morphological and molecularly, and are genetically related to a juvenile isolated from the liver of Didelphis marsupialis, in the Ostuta River basin, Oaxaca. They are different from the 3 species of Gnathostoma described from Mexico by body size and the hooks of the cephalic bulb in the AdvL3 stage, as well as, in the presence of a cuticular pouch at the posterior end of the juvenile male. Through the COI molecular marker, a genetic distance analysis, and phylogenetic inference among the species of the genus, we conclude that Gnathostoma sp. I is closely related to, but distinct from G. turgidum and from other species found in Mexico and worldwide, even though there is not enough material to establish it as a new species. Additionally, based on morphologic characteristics, we documented the discovery of AdvL3 of G. lamothei (in Rhambdia guatemalensis and Lontra longicaudis) and AdvL3 of another unidentified species (in R. guatemalensis and Synbranchus marmoratus), which is distinct to above according to morphologic and molecular evidence.
Keywords: Gnathostoma spp.; Advanced third stage; Phylogeny; Mexico; Marsupials
Introducción
Entre el enorme conjunto de especies de helmintos que se distribuyen en México se encuentra el género Gnathostoma Owen, 1836(Spirurida: Gnathostomatidae) conformado por 12 especies válidas (Almeyda-Artigas, 1991; Bertoni-Ruiz et al., 2005; Miyazaki, 1954). Tres de ellas se distribuyen en México: Gnathostoma binucleatum Almeyda-Artigas, 1991; Gnathostoma turgidum Stossich, 1902 y Gnathostoma lamothei Bertoni-Ruiz, García-Prieto, Osorio-Sarabia y León-Règagnon, 2005 (Gaspar-Navarro et al., 2013). Las especies presentan una alta especificidad hacia mamíferos carnívoros como sus hospederos definitivos; G. binucleatum (Canidae, Felidae, Suidae), G. lamothei (Procyonidae) y G. turgidum (Didelphidae) (Pérez-Álvarez et al., 2008). El hospedero definitivo adquiere la infección al alimentarse de los segundos hospederos intermediarios, peces dulceacuícolas para las 2 primeras especies (Almeyda-Artigas, 1991; Bertoni-Ruiz et al., 2005), ranas y accidentalmente peces para la última (Mosqueda-Cabrera et al., 2009, 2023).
El objetivo de la presente investigación fue describir un morfotipo de Gnathostoma que difiere morfológicamente de las especies conocidas para didélfidos de México, proveniente de una zona no explorada previamente, la cuenca del río Ostuta, Oaxaca.
Materiales y métodos
La cuenca del río Ostuta forma parte de la porción oriente de la región hidrográfica Tehuantepec (RH22). Se localiza en la zona suroriente del estado de Oaxaca, que limita con Chiapas. La laguna Las Garzas (16°17’46” N, 94°27’17” O), es un cuerpo de agua semipermanente, remanente de un antiguo cauce de río ubicado en la región hidrográfica Costa de Chiapas (RH23) en la cuenca del mar Muerto, que colinda al oeste con la cuenca del río Ostuta (Conagua, 2021) y es irrigada por la misma durante lluvias torrenciales (fig. 1).
Esta investigación fue conducida debido al hallazgo fortuito de larvas tercer estadio avanzado (AdvL3) en las heces de la nutria neotropical Lontra longicaudis de la cuenca del río Ostuta, Oaxaca durante abril y mayo de 2018. Posteriormente, durante el 2022 se realizó la búsqueda de larvas de Gnathostoma en peces de este río y en cuerpos de agua asociados a la región hidrográfica (RH23). Para su captura se utilizaron redes de pesca como atarrayas y chinchorros. La musculatura de los peces fue revisada a contraluz entre 2 vidrios y posteriormente digerida con pepsina artificial (16 gr de pepsina, 6 gr de NaCl y 8 ml de HCl en 1 L de agua). La búsqueda de las larvas se realizó con ayuda de un microscopio estereoscópico; fueron fijadas en alcohol etílico al 70% caliente y conservadas en alcohol etílico al 70% frío. Para su estudio fueron transparentadas con lactofenol de Amman y observadas bajo el microscopio compuesto. Todas las medidas se presentan en micras, se especifica el rango y entre paréntesis el promedio seguido de la desviación estándar y el número de observaciones. Los parámetros de la infección fueron calculados de acuerdo con Bush et al. (1997). Se tomaron fotografías con una cámara digital montada a un microscopio óptico y los dibujos fueron realizados con ayuda una cámara clara. La captura y el sacrificio del tlacuache común Didelphis marsupialis fue realizada de acuerdo con Almeyda-Artigas et al. (2010) e identificado por la morfología craneal siguiendo a Gardner (1973). El material de referencia fue depositado en la Colección Nacional de Helmintos (CNHE) del Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México (IB-UNAM). La obtención de los organismos se realizó bajo el permiso de colecta SCPA/DGVS/03184/22 expedido por la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, México.
Figura 1. Cuenca del río Ostuta, Oaxaca en la región hidrográfica Tehuantepec (RH22). Laguna Las Garzas en la región hidrográfica Costa de Chiapas (RH23). Mapa elaborado por D.L. Desentis Pérez.
La extracción del DNA se llevó a cabo utilizando el kit de extracción DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). Se amplificó la región del segundo espaciador interno transcrito (ITS2) y la subunidad I del citocromo c oxidasa (COI) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). La amplificación de las secuencias nucleotídicas parciales de los genes mencionados se llevó a cabo a partir de reacciones compuestas por una solución de 8.5 µl de H2O, 3 µl de buffer 5x, 0.2 µl de cada oligonucleótido, 0.1 µl de enzima Taq polimerasa (Bioline) y 3 µl de DNA genómico en un volumen total de 15 µl. La región ITS2 se amplificó con los oligonucleótidos NEWS2 (forward) 5ʼ-TGTGTCGATGAAGAACGCAG-3ʼ e ITS2-RIXO (reverse) 5ʼ-TTCTATGCTTAAATTCAGGGG-3ʼ (Almeyda-Artigas et al., 2000a), con el siguiente perfil térmico: 1 ciclo de 94 °C por 1 min; 5 ciclos de 92 °C por 30 s, 45 °C por 30 s y 72 °C por 1 min; 35 ciclos de 92 °C por 30 s, 53 °C por 30 s y 72 °C por 1 min; elongación final a 72 °C por 4 min. Las secuencias parciales del gen mitocondrial COI se amplificaron con los cocteles de oligonucleótidos previamente preparados según Prosser et al. (2013), utilizando los siguientes oligonucleótidos: NemF1_t15ʼCRACWGTWAATCAYAARAATATTGG3-ʼ, NemF2_t1 5ʼ-ARAGATCTAATCAT
AAAGATATYGG3-ʼ, NemF3_t1 5ʼ-ARAGTTCTAATCATAARGATATTGG-3ʼ (forward) y NemR1_t1 5ʼ-AAACTTCWGGRTGACCAAAAAATCA-3ʼ, NemR2_t1 5ʼ-AWACYTCWGGRTGMCCAAAAAAYCA-3ʼ, NemR3_t1 5ʼAAACCTCWGGATGACCAAAAAATCA-3ʼ (reverse) implementando el siguiente perfil térmico: 1 ciclo de 94 °C por 1 min; 5 ciclos de 94 °C por 40 s, 45 °C por 40 s y 72 °C por 1 min; 35 ciclos de 94 °C por 40 s, 53 °C por 40 s y 72 °C por 1 min; elongación final a 72 °C por 5 min. Los productos de la PCR fueron purificados mediante el kit de purificación QUIAquick PCR (50) (QIAGEN). Las secuencias fueron obtenidas mediante el secuenciador de DNA automatizado ABI Prism 310 en el Laboratorio de Secuenciación Genómica del PABIO-UNAM. En el caso del ITS-2 se usaron los oligonucleótidos: NEWS2 e ITS2-RIXO para la secuenciación, en el caso del COI se usaron los oligonucleótidos M13F (5ʼ-TGTAAAACGACGGCCAGT-3ʼ) y M13R (5ʼ-CAGGAAACAGCTATGAC-3ʼ) (Messing, 1993).
Las secuencias obtenidas se alinearon en el programa MAFFT V7 (en línea) con sus homólogas (COI/ITS2) disponibles en el repositorio GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information), correspondientes a especies nominales del género Gnathostoma en México y una especie del género Anisakis (A. pegreffi FJ907317/AY603531) como grupo externo: G. binucleatum (AB180103/EU915244), G. lamothei (KF648543), G. turgidum (KT894798/KF648548), G. spinigerum (AB037132/KF648553), G. nipponicum (JQ824059/JN408314), G. hispidum (JQ824056/JQ824057). A partir de los alineamientos múltiples de secuencias se realizó un análisis de distancias genéticas en el programa MEGA X 11.0.13 para establecer la similitud entre las distintas especies utilizando el modelo Kimura 2 parámetros (K2P) de acuerdo con Hebert et al. (2003). El análisis filogenético se realizó con los 2 marcadores moleculares (COI, ITS-2), de manera independiente y posteriormente fueron concatenados con un ajuste manual en el programa Mesquite v. 3.6 (Maddison y Maddison, 2019). La inferencia filogenética se realizó utilizando el criterio de inferencia bayesiana (IB) en el programa MrBayes v. 3.2.1 (Ronquist et al., 2012). Los resultados se ilustraron en un árbol filogenético construido en el programa FigTree v. 1.4.2 (Rambaut, 2006).
Descripción
Gnathostoma sp. I (figs. 2-4)
Juvenil. Bulbo cefálico con ganchos de una sola punta dispuestos en 10 hileras completas, mide 393.6 × 861, de largo y ancho, respectivamente. Dos papilas cervicales laterales, derecha e izquierda, ambas en la décima hilera. Ancho del cuerpo a la altura de la intersección esófago-intestino 1,479.60. Esófago de 14,586.39 de largo × 836.10 de ancho, cubre 58.3% respecto al ancho del cuerpo. Cuatro sacos cervicales se proyectan desde la base del bulbo cefálico, en promedio miden 2,379.69 de largo, 16.31% respecto al largo del esófago. Bursa con pequeñas espinas ventrales en sentido posteroanterior, presenta 4 pares de papilas pedunculadas; 2 pares preanales, un par adanal y 2 pares postanales; además, 4 pares de papilas no pedunculadas; un par preanal, 2 pares adanales y un par postanal. Dos espículas, la derecha 3,267.43 de largo × 142.68 de ancho; la izquierda 949.41 largo × 93.48 de ancho; proporción de 1:3.4; el extremo posterior con cutícula holgada más larga que el cuerpo, similar a un prepucio.
Espinas corporales presentes solo en la región anterior del cuerpo con variaciones en el número de puntas según la región; a, inmediatamente posteriores al bulbo cefálico, con 5-7 puntas son comunes las de 5, más largas (49.06) que anchas (22.08); b, en la región que ocupan las papilas cervicales, de 5-9 puntas son comunes las de 7 y 8, con 61.32 de largo y 31.89 de ancho; c, a la altura de los sacos cervicales, con 5 a 10, más largas (108.24) que anchas (75.80), con una a 3 puntas laterales y tronco central con 3 y 5 puntas; d, a la altura de la intersección esófago-intestino, espinas con 5 a 6 puntas más anchas que largas, 59.04 y 39.36, respectivamente, las puntas laterales generalmente más cortas y con 3 a 4 puntas centrales; e, posterior a la intersección esófago-intestino, cambian drásticamente de forma y tamaño, siendo más largas (59.04) que anchas (34.44) con un par de puntas laterales cortas y de 2 a 3 puntas centrales de igual tamaño; en la parte más posterior de la porción escamada del cuerpo se observa un gradiente donde las puntas centrales de las espinas van ensanchándose y desapareciendo las puntas laterales hasta terminar en espinas de una sola punta.
Datos morfológicos adicionales (basados en la observación directa de especímenes depositados en la CNHE 4739): macho obtenido del estómago de Didelphis marsupialis. Mide 46,000 de largo por 2,182.41 de ancho máximo. Esófago 6,625 por 542.52 de largo y ancho, respectivamente; cubre 14.4% respecto a la longitud del cuerpo. Dos papilas cervicales en 11 (izquierda) y 10 (derecha), sobre las hileras de espinas del cuerpo. Bulbo cefálico 442.80 por 939.72 de largo y ancho, respectivamente, con 9 hileras completas de ganchos con una sola punta de base gruesa y cónica. Extremo posterior con cutícula holgada corrugada y arreglo de las espinas en el cuerpo iguales a la forma juvenil que aquí se describe. Las espinas cubren 61% del cuerpo.
Resumen taxonómico
Hospedero: tlacuache común Didelphis marsupialis Linnaeus, 1758 (Didelphimorphia: Didelphidae).
Sitio de infección: hígado.
Localidad: inmediaciones del río Ostuta, San Francisco Ixhuatán, Oaxaca.
Depósito de especímenes: CNHE 12827.
Comentarios taxonómicos
Para propósitos comparativos, estudiamos especíme-
nes de G. turgidum de D. marsupialis (CNHE 4739) y G. turgidum de D. virginiana (CNHE 4261, 4740, 4736). La presencia de una cutícula holgada en el extremo posterior en la forma juvenil estudiada en este trabajo y su ausencia en el adulto de G. turgidum (CNHE 4739), así como el porcentaje espinado del cuerpo (61% vs. 40%, respectivamente), son las únicas características diferentes entre las especies. La relación entre las espículas del macho, el número de puntas y arreglo de las espinas en el cuerpo no mostraron diferencias entre ambos lotes de material.
Los fragmentos de gen amplificados, ITS-2 (480 pb) y COI (702 pb), se encuentran disponibles en GenBank con números de acceso PQ149238 y PQ143178, respectivamente, y pertenecen al segundo tercio del juvenil de Gnathostoma sp. I
Figura 2. Gnathostoma sp. I parásito de D. marsupialis. a) Espícula derecha y cutícula holgada del extremo posterior; b) patrón de espinación de la bursa con papilas ventrales y laterales.
Figura 3. Extremo posterior de juvenil de Gnathostoma sp. I. (a) Cutícula holgada; b) espícula derecha y papilas de la bursa. Escala de las barras = 200 μm.
Las notables diferencias morfológicas en el tamaño del cuerpo entre las AdvL3 de Gnathostoma aisladas de los peces D. latifrons y las de G. turgidum (tabla 1), así como el tamaño de los ganchos en las 4 hileras del bulbo cefálico, nos condujeron a pensar que pudieran tratarse de especies independientes. El análisis de distancias genéticas de las secuencias (modelo K2P del ITS2) determinó que las AdvL3 obtenidas de D. latifrons y el juvenil obtenido de D. marsupialis son iguales entre sí pero también muy similares a las secuencias de G. turgidum con valores de 0.0043 para el juvenil y 0.0046 para la AdvL3. En cuanto al marcador molecular COI, en el análisis de distancias genéticas de las secuencias registramos una distancia genética de 0.0657 con respecto a las ya mencionadas y la secuencia de G. turgidum. Basados en estos datos, nuestro material podría representar una variante de G. turgidum o una especie cercanamente relacionada a ésta (fig. 5). Sin embargo, y pese a las diferencias morfológicas tan claras entre ambos taxones, preferimos adoptar una posición conservadora y no establecer a las larvas y al juvenil que recuperamos en el río Ostuta, Oaxaca, como una especie independiente hasta contar con una mayor cantidad de evidencias, tanto morfológicas (de hembras y machos adultos) como moleculares.
Figura 4. Arreglo de las espinas en el cuerpo de Gnathostoma sp. I. a) Primeras hileras del cuerpo; b) región de la papila cervical; c) región distal de los sacos cervicales; d) intersección esófago-intestino; e) región final de la superficie espinada. Escala de la barra = 100 μm.
Gnathostoma sp. I (figs. 6, 7)
Larva de tercer estadio avanzado. La siguiente descripción está basada en la observación de 23 larvas. El cuerpo mide 1,149-1,414 (1, 262 ± 90.86; 11) de largo y 94.71-129.77 (105.82 ± 12.59; 11) de ancho; está cubierto totalmente por hileras de espinas transversales, cuyo número oscila entre 180-223 (192.79 ± 11.82; 13). Bulbo cefálico 30.77-85.85 (44.69 ± 14.57; 13) de largo × 65.23-169.24 (91.90 ± 26.72; 13) de ancho; presenta espinas dispuestas en 4 hileras transversales: 27-37 (31.17 ± 2.59; 23), 28-44 (34.39 ± 3.78; 23), 30-44 (37.22 ± 3.42; 23) y 33-46 (41.26 ± 3.75; 23), de la primera a la cuarta, respectivamente. Miden: 4.44-6.22 (5.33 ± 0.68) × 1.77-2.66 (2.28 ± 0.31), 5.33-5.77 (5.64 ± 0.21) × 2.22-2.66 (2.35 ± 0.21), 5.33-6.22 (5.65 ± 0.34) × 2.66-3.55 (3.11 ± 0.26), 4.44-4.88 (4.82 ± 0.17) × 2.66-3.55 (3.11 ± 0.36), largo y ancho de la primera a la cuarta hilera, respectivamente. Cuatro sacos cervicales ocupan de 43.23 a 75.29% (58.99 ± 7.65; n = 10) de la longitud de esófago. El esófago abarca de 32 a 73.81% (40.30 ± 2.60; n = 10) del largo total y 51% de su ancho, a la altura de la intersección esófago-intestino. El poro excretor ventral, se ubica en las hileras 15-21 (18.73 ± 1.60; n = 15). Dos papilas cervicales laterales, la derecha situada en la hilera 9-13 (10.58 ± 1.20; n = 19) y la izquierda en la hilera 9-16 (11.11 ± 1.60; n = 18). Primordio genital ubicado en 65.61 a 69.67% (68.39 ± 0.56; n = 4) del cuerpo. Dos papilas caudales, la derecha anterior al primordio genital de 58.06 a 70.91% (62.82 ± 2.27; n = 11) y la izquierda inmediatamente posterior al primordio genital ubicada en 61.26 a 81.56% (72.85 ± 4.18; n = 11) del extremo anterior del cuerpo, respectivamente.
Tabla 1
Comparación morfométrica entre larvas de tercer estadio avanzado de las 3 especies de Gnathostoma en México. PCi = Papila cervical izquierda, PCd = papila cervical derecha, PE = poro excretor, Ea = ancho del esófago, Ca = ancho del cuerpo, — sin datos.
| Especie referencia | Largo / ancho | PE | Proporción Ea vs. Ca | Cantidad de ganchos en las hileras del bulbo cefálico | ||||
| I | II | III | IV | IV-I | ||||
| G. lamothei | ||||||||
| Gaspar-Navarro et al (2013) a | 3,582.24-5,095.90 (4,487.94) / 236.60-318.24 (288.74) | 20-29 (23.07) | (0.41) | 34-44 (39.33) | 38-47 (43.27) | 40-48 (44.20) | 45-58 (47.33) | (7.13) |
| Cole et al. (2014) b | — | — | — | 36 | 38 | 36 | 36 | 0 |
| Presente estudio c | 1,879.44-1,928.64 (1,906.36) / 245.28-260.76 (253.71) | 20-23 (21.33) | (0.57) | 41-45 (42.33) | 43-45 (44.33) | 46-49 (47.33) | 49-51 (50.00) | (7.67) |
| Presente estudio d | 3,104.52 / 225.66 | 26 | 0.71 | 42 | 47 | 45 | 47 | 5 |
| G. turgidum | ||||||||
| Mosqueda-Cabrera et al. (2009) e | 1,530.00-2,007.40 (1,670.20) / 134.6-160.4 (140.80) | 15-22 (19.7) | 26-34 (30.80) | 29-38 (34.00) | 29-43 (36.70) | 33-42 (39.60) | (8.80) | |
| Díaz-Camacho et al. (2010) f | 1,300-4000 (2,700.00) / — | — | — | (34.00) | (37.00) | (36.00) | (42.00) | (8.00) |
| Cole et al., 2014 g | — | — | — | 32-37 (35.00) | 34-40 (37.40) | 36-41 (38.20) | 42-48 (44.20) | (9.20) |
| Mosqueda-Cabrera et al. (2023) h | 1,544 / 142.3 | 21 | 0.65 | 34 | 36 | 40 | 45 | 11 |
| Gnathostoma sp. I | ||||||||
| Presente estudio i | 1,234.80 / 115.28 | 15 | 0.45, — | 25, 32 | 27, 33 | 28, 36 | 36, 42 | 11, 10 |
| Presente estudio j | 1,149.10-1,413.39 (1,262.7) / 94.71-129.77 (105.82) | 15-21 (18.73) | (0.51) | 27-37 (31.17) | 28-44 (34.39) | 30-44 (37.22) | 33-46 (41.26) | (10.04) |
| G. binucleatum | ||||||||
| Almeyda-Artigas (1991) k | 2,600-5,900 (4,300.00) / — | — 27-37 (30.00) | (0.70) * | 35-44 (38.90) | 38-47 (42.40) | 40-49 (44.70) | 43-52 (48.20) | (9.5) |
| García-Márquez et al. (2009) l | 3,120-3,140 (3,130.00) / — | — (30.00) | — | 36-29 (38.00) | 40-41 (40.00) | 44-46 (45.00) | 44-47 (46.00) | (8.00) |
| Gnathostoma sp. II | ||||||||
| Presente estudio m | 1,919- 1,989 / 137-145 ** | 17-25 (20.33) | (0.66) | 33-37 (34.33) | 35-43 (38.00) | 38-43 (40.67) | 41-47 (44.67) | (10.3) |
a Larvas obtenidas experimentalmente de Lithobates heckscheri, b de una larva obtenida de la musculatura de M. albus,c de 3 larvas encontradas en excretas de L. longicaudis, d de una larva obtenida de la musculatura de Rhamdia guatemalensis, e de 11 larvas obtenidas de la musculatura de R. sweifeli, f de 28 larvas obtenidas del hígado de Didelphis virginiana (S-L3), g de 5 larvas obtenidas de la musculatura de M. albus, h de una larva obtenida de la musculatura de Gobiomorus dormitor,i de 2 larvas obtenidas de la musculatura de Rhamdia guatemalensis, j de 23 larvas obtenidas de la musculatura de Dormitator latifrons, k de 30 larvas obtenidas de la musculatura de Petenia splendida, l de 8 larvas obtenidas de la musculatura de D. latifrons y Sciades guatemalensis, m de 3 larvas 2 obtenidas de la musculatura de S. marmoratus y una de la musculatura de R. guatemalensis. * Datos de Gaspar-Navarro et al. (2013). ** Datos de 2 larvas.
Figura 5. Relaciones filogenéticas entre Gnathostoma sp. I y algunas especies del género Gnathostoma inferidas mediante los marcadores moleculares (COI/ITS-2). Los valores de probabilidad bayesiana se indican en los nodos.
Resumen taxonómico
Localidad: laguna Las Garzas, San Francisco Ixhuatán, Oaxaca.
Hospedero: Dormitator latifrons (Eleotridae).
Otros hospederos: Rhamdia guatemalensis (Heptapteridae).
Sitio de infección: musculatura.
Parámetros de infección: prevalencia 30.6%, intensidad promedio 4.8, abundancia promedio 1.47.
Distribución en el hospedero: 51 larvas en 11 hospederos: 0 (25), 1 (3), 2 (2), 3 (1), 6 (2), 7 (2), 15 (1).
Depósito de especímenes: CNHE 11674.
Comentarios taxonómicos
Las AdvL3 de Gnathostoma sp. Ison similares a las de G. turgidum (Mosqueda-Cabrera et al., 2009, 2023) en la cantidad de ganchos en las hileras del bulbo cefálico y en la ubicación de las papilas cervicales y el poro excretor. Sin embargo, difieren en el tamaño del cuerpo (tabla 1), en la forma de los ganchos de las hileras del bulbo cefálico, ligeramente redondos en los ejemplares que ahora describimos (fig. 7a) vs. rectangulares (fig. 1, Mosqueda-Cabrera et al., 2009, 2023; en ambos fig. 1) en G. turgidum; asimismo, las dimensiones de los ganchos de la segunda y tercera hileras son iguales y mayores que los de la primera y cuarta hileras en el material de la laguna Las Garzas mientras que en G. turgidum los ganchos de la cuarta hilera son menores con respecto a los de las 3 hileras precedentes.
Las AdvL3 de Gnathostoma sp. I se diferencian de las de G. lamothei (Gaspar- Navarro et al., 2013) y G. binucleatum (Almeyda-Artigas, 1991) en el tamaño del cuerpo, ya que son más pequeñas; además, presentan menor cantidad promedio de ganchos en las hileras del bulbo cefálico. Finalmente, la posición del poro excretor se traslapa con la de Gnathostoma sp. II, y es diferente de G. lamothei y G. binucleatum (tabla 1).
Los fragmentos de gen amplificados, ITS-2 (496 pb) y COI (694 pb), se encuentran disponibles en el GenBank con número de acceso PQ149241 y PQ141296, respectivamente.
Los primeros reportes del material que describimos es este trabajo fueron realizados por Almeyda-Artigas et al. (2000a, b). Las secuencias del ITS2 del DNA ribosomal de las AdvL3 obtenidas experimentalmente de D. marsupialis por estos autores fueron nombradas como Gnathostoma sp. III, y de acuerdo con ellos, no fueron distintas a las de G. turgidum, no obstante las diferencias morfológicas observadas ahora.
Figura 6. Gnathostoma sp. I. a) Larva de tercer estadio avanzado; b) ganchos en las hileras del bulbo cefálico; c) extremo anterior del cuerpo. Escala de las barras, a = 200 μm, b y c = 10 μm.
Gnathostoma sp. I (fig. 8)
Larva de tercer estadio temprano. Descripción basada en la observación de 3 larvas envueltas en un quiste. Longitud del cuerpo 494.90-676.20 (563.06 ± 99.36; 3) y 225.40-380.18 (314.56 ± 80.03; 3) del esófago. El esófago cubre el 45.54-73.81% (56.45 ± 15.20; 3) de la longitud del cuerpo. Cuatro sacos cervicales 223.21 (n = 1) ocupan 43.33% del largo del esófago. Bulbo cefálico con 4 hileras transversales de ganchos 29-33 (30.67 ± 2.08; 3), 29-36 (32.33 ± 3.51; 3), 31-38 (35.00 ± 3.61; 3) y 37-45 (39.67 ± 4.62; 3), respectivamente.
Resumen taxonómico
Localidad: laguna Las Garzas, San Francisco Ixhuatán, Oaxaca.
Hospedero: Dormitator latifrons (Eleotridae).
Sitio de infección: musculatura.
Parámetros de infección: prevalencia 2.8%, IP 3.0, AP 0.08.
Depósito de especímenes: CNHE 11826.
Comentarios taxonómicos
Las larvas presentan características propias de tercer estadio temprano (EaL3) por el tamaño del cuerpo (563) y la forma de los ganchos (fig. 8b). Esta fase se desarrolla en copépodos y no existe registro de EaL3 enquistadas en la musculatura de los segundos hospederos intermediarios como las que aquí se documentan. No pudo ser recuperado material molecular de las larvas.
Figura 8. Larva de tercer estadio temprano de Gnathostoma sp. I enquistada en la musculatura de Dormitator latifrons. a) Bulbo cefálico; b) ganchos en las hileras del bulbo cefálico. Escala de la barra = 10 μm.
Gnathostoma lamothei Bertoni-Ruiz, García-Prieto, Osorio-Sarabia y León-Règagnon (2005) (fig. 9)
Larva de tercer estadio avanzado. La siguiente descripción está basada en la observación de 3 larvas. El cuerpo mide 1,879.44-1,928.64 (1,906.36 ± 24.9) de largo y 245.28-260.76 (253.71 ± 7.8) de ancho. Cuatro sacos cervicales se proyectan desde el inicio del cuerpo y cubren 53.83-66.37% (59.32 ± 6.4), con respecto a la longitud del esófago. Cuerpo cubierto totalmente de diminutas espinas dispuestas en hileras transversales de 209-240 (220 ± 17.3). Bulbo cefálico 73.58-85.85 (81.48 ± 6.9) por 176.6-205 (192.61 ± 14.5) de largo y ancho, respectivamente. Bulbo cefálico con espinas dispuestas en 4 hileras transversales, 41-45 (42.33 ± 2.3), 43-45 (44.33 ± 1.2), 46-49 (47.33 ± 1.5) y 49-51 (50.00 ± 1.0), de la primera a la cuarta, respectivamente. Poro excretor ventral entre las hileras 20-23 (21.33 ± 1.5) del cuerpo. Dos papilas cervicales laterales, la izquierda entre las hileras 9-15 (11.33 ± 3.2) y la derecha 10-14 (11.33 ± 2.3; 3) del cuerpo. El esófago ocupa 38.48-42.51% (40.47 ± 2.0) del cuerpo, en promedio abarca 57% del ancho a la altura de la intersección esófago-intestino. Dos papilas caudales laterales, la izquierda a 130-144 (137.33 ± 7.0) hileras del cuerpo y la derecha a 123-149 (136.67 ± 13.1). Primordio genital no observado. Ano subterminal, a 122.64 (n = 1) del extremo posterior.
Figura 9. Larva de tercer estadio avanzado de Gnathostoma lamothei. a) Vista lateral del bulbo cefálico; b) vista lateral del poro excretor; c) vista frontal de la papila cervical; d) intersección esófago-intestino; e) cola. Escala de la barra = 25 μm.
Resumen taxonómico
Localidad: río Ostuta.
Hospedero: excreta de Lontra longicaudis (Mustelidae).
Prevalencia: (1/20) 5.0%.
Otros hospederos: musculatura de Rhamdia guatemalensis (Heptapteridae).
Depósito de especímenes: CNHE 11160.
Comentarios taxonómicos
La AdvL3 de G. lamothei ha sido descrita únicamente con datos morfométricos a partir de hospederos infectados experimentalmente (Gaspar-Navarro et al., 2013). Ha sido identificada en 2 registros, a partir de datos sobre la cantidad de ganchos de una larva obtenida de Monopterus albus de agua abiertas de Florida en EUA (Cole et al., 2014), y el otro con datos moleculares de AdvL3 obtenidas de Gobiomorus dormitor en Tabasco, México (Hernández-Gómez et al., 2010). La presente investigación describe por primera vez a la AdvL3 de G. lamothei a partir de hospederos infectados de manera natural, descripción que coincide con la obtenida de infecciones experimentales (Gaspar-Navarro et al., 2013), pero difiere con la larva de Florida (Cole et al., 2014) por el menor número de ganchos, los datos taxonómicos de esta larva son más parecidos a G. turgidum, pero identificada con marcadores moleculares como G. lamothei (tabla 1). En la presente investigación, no pudo ser recuperado material molecular de las larvas por el método de fijación de las excretas de nutria usando formaldehído.
Gnathostoma sp. II (fig. 10).
Larva de tercer estadio avanzado. Descripción basada en la observación de 3 larvas. Larvas con fluido blastocelómico rojo. Cuerpo 1,918.80-1989.5 × 137.36- 144.72 de largo y ancho, respectivamente. Presenta 197-210 hileras transversales de espinas en todo el cuerpo. Bulbo cefálico 61.32-80.94 (67.86 ± 11.3) × 117.73-116.79 (134.90 ± 27.6), de largo por ancho, respectivamente. Cuatro hileras transversales de ganchos en el bulbo cefálico 33-37 (34.33 ± 2.3; 3), 35-43 (38.00 ± 4.4), 38-43 (40.67 ± 2.5), 41-47 (44.67 ± 3.2), de la primera a la cuarta, respectivamente. Poro excretor ventral entre las 17-25 (20.33 ± 4.2) hileras del cuerpo. Dos papilas cervicales laterales en la porción anterior del cuerpo, la derecha 10-15 (12.00 ± 2.6) y la izquierda 10-16 (12 ± 3.5), en las hileras de espinas del cuerpo. El esófago abarca 34.9-38.5% del total del cuerpo y cubre 58.9-59.3% del ancho del cuerpo, en la intersección esófago-intestino. Presenta 4 sacos cervicales, en promedio cubren 42.1-44.7% del largo del esófago. Primordio genital en 68.0-82.3% del cuerpo. Papilas caudales no observadas. Ano subterminal, a 29.43-34.34 del extremo posterior.
Resumen taxonómico
Localidad: río Ostuta, San Francisco Ixhuatán, Oaxaca.
Hospedero: Synbranchus marmoratus (Symbranchidae)
Otros hospederos: Rhamdia guatemalensis (Heptapteridae).
Sitio de infección: musculatura.
Depósito de especímenes: CNHE 11708, 11709.
Comentarios taxonómicos
Las AdvL3 de Gnathostoma sp. II son diferentes a las de Gnathostoma sp. I descritas en este trabajo, G. turgidum (Mosqueda-Cabrera et al., 2009, 2023), G. lamothei (Gaspar-Navarro et al., 2013)y G. binucleatum (Almeyda-Artigas, 1991) en la forma y tamaño de los ganchos de las 4 hileras del bulbo cefálico; además, presentan ganchos más grandes, tanto en la base como en la hoja; son diferentes a Gnathostoma sp. I y G. turgidum por la mayor cantidad de ganchos en las hileras del bulbo cefálico y por el mayor tamaño del cuerpo (tabla 1); en este aspecto, son más pequeñas que G. binucleatum y G. lamothei, y diferentes a estas especies en la ubicación del poro excretor (tabla 1).
Los fragmentos de gen amplificado ITS-2 (367 pb), se encuentra disponible en el GenBank con número de acceso OR428675 (ITS-2) y pertenece al cuerpo (sin el bulbo cefálico) de una de las AdvL3 (Gnathostoma sp. II) del presente estudio. El análisis molecular y filogenético sugiere que Gnathostoma sp. II representa una especie distinta; no obstante, el escaso material disponible imposibilita erigirla como especie nueva.
Discusión
Los ciclos de vida complejos como el que presentan las especies del género Gnathostoma determinan que su estudio sea fragmentado y no se tenga claridad en muchos aspectos. Esto es importante ya que la gnathostomiasis humana es una enfermedad parasitaria con alta incidencia principalmente en Asia y en Latinoamérica. En México, se ha demostrado que la especie causante de esta parasitosis humana es G. binucleatum (Almeyda-Artigas 1991; Álvarez-Guerrero y Alba-Hurtado, 2007); sin embargo, es necesario conocer con mayor detalle los ciclos de vida de las otras 2 especies distribuidas en el país debido a su potencial zoonótico. Mosqueda-Cabrera et al. (2009) descartaron el papel de los peces como hospederos intermediarios de G. turgidum debido a la falta de hallazgos naturales; sin embargo, recientemente, la AdvL3 de esta especie fue aislada de la musculatura de peces (Gobiomorus dormitor) (Mosqueda-Cabrera et al., 2023), confirmando su potencial zoonótico. Los autores resaltaron la posibilidad de que en los estudios sobre gnatostomosis en peces, las larvas de G. turgidum pasaran desapercibidas por su tamaño y método de búsqueda (observación a contraluz de la musculatura entre 2 vidrios). Este también sería el caso de las larvas Gnathostoma sp. I, colectadas en el río Ostuta, ya que son aún más pequeñas, y solo fueron encontradas usando un microscopio estereoscópico; en consecuencia, es importante valorar la participación de éstas en la gnatostomiasis humana.
Figura 10. Larva de tercer estadio avanzado de Gnathostoma sp. II. a) Vista frontal del bulbo cefálico; b) poro excretor; c) papila cervical; d) intersección esófago-intestino; e) cola. Escala de la barra = 20 μm.
Entre las especies de Gnathostoma, existe un complejo infectando diferentes especies de hospederos muy emparentados filogenéticamente. Se conoce que el mapache (Procyon lotor) es parasitado por 2 especies de Gnathostoma con alta especificidad hospedatoria: G. lamothei asociado a Procyon lotor hernandezii Wagler, 1831 y G. procyonis a la subespecie Procyon lotor lotor Linnaeus, 1758. Las formas adultas de ambas especies son muy parecidas entre sí, con diferencias únicamente en el tamaño de las espículas, el número de puntas de las escamas transversales del cuerpo en la región posterior al bulbo cefálico y a la altura de la papila, así como en la ausencia de escamas en la mitad posterior de cuerpo (presencia de “bosses”) en G. lamothei (Bertoni-Ruiz et al., 2005). Por otra parte, el género Didelphis Linnaeus, 1758 comprende 6 especies de marsupiales que se distribuyen en toda América (Gardner, 1973); entre éstas, D. marsupialis Linnaeus, 1758 es una especie con distribución neotropical y D. virginiana Kerr, 1792 con una neártica (Dias y Perini, 2018); ambas están presentes en México y se han reportado como hospederos definitivos de G. turgidum (Pérez-Álvarez et al., 2008). La evidencia de un complejo de diferentes especies de Gnathostoma en las 2 subespecies de prociónidos sugeriría la hipótesis de que cada especie de marsupial pueda actuar como hospedero definitivo de especies diferentes de Gnathostoma; D. virginiana para G. turgidum y D. marsupialis para el material descrito en este trabajo, ya que ambas especies son muy parecidas entre sí, y sus hospederos están estrechamente relacionados filogenéticamente. No obstante, como se señaló anteriormente, consideramos que es necesario obtener más información de campo y laboratorio para apuntalar esta hipótesis.
Agradecimientos
Agradecemos profundamente la colaboración de Luis García Prieto (CNHE) durante la colecta de peces y helmintos, además, por el préstamo de especímenes y literatura. A Edgar Uriel Montes de Oca y Andrés Velázquez Brito de la CNHE por su valiosa ayuda con los datos moleculares. A Gerardo Torres Carrera por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos el servicio del Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biología de la UNAM, como parte del Laboratorio Nacional de Biodiversidad, y en particular el apoyo técnico de A. Jiménez-Marín, N. López y L. Márquez.
Referencias
Almeyda-Artigas, R. J. (1991). Hallazgo de Gnathostoma binucleatum n. sp. (Nematoda: Spirurida) en felinos silvestres y el papel de peces dulceacuícolas y oligohalinos como vectores de la gnathostomiasis humana en la cuenca baja del río Papaloapan, Oaxaca-Veracruz, México. Anales del Instituto Ciencias del Mar y Limnología, Universidad Nacional Autónoma de México, 18, 137–155.
Almeyda-Artigas, R. J., Bargues, M. D. y Mas-Coma, S. (2000a). ITS-2 rDNA sequencing of Gnathostoma species (Nematoda) and elucidation of the species causing human gnathostomi-asis in the Americas. Journal of Parasitology, 86, 537–544. https://doi.org/10.1645/0022-3395(2000)086[0537:irsogs]2.0.co;2
Almeyda-Artigas, R. J., Bargues, M. D. y Mas-Coma, S. (2000b). rDNA of Gnathostoma species (Nematoda): ITS-2 microsatellites and 5.8 S gene secondary structure. Research and Reviews in Parasitology, 60, 51–56.
Almeyda-Artigas, R. J., Mosqueda-Cabrera, M. Á. y Sánchez-Núñez, E. (2010). Precocity of Gnathostoma turgidum in naturally infected four-eyed opossum Philander opossum pallidus from Temascal, Oaxaca, Mexico. Parasitology Research, 106, 439–443. https://doi.org/10.1007/s00436-009-1682-8
Álvarez-Guerrero, C. y Alba-Hurtado, F. (2007). Estuarine fish and turtles as intermediate and paratenic hosts of Gnathostoma binucleatum in Nayarit, Mexico. Parasitology Research, 102, 117–122. https://doi.org/10.1007/s00436-007-0738-x
Bertoni-Ruiz, F., García-Prieto, L., Osorio-Sarabia, D. y León-Règagnon, V. (2005). A new species of Gnathostoma (Nematoda: Gnathostomatidae), parasite of Procyon lotor hernandezii from Mexico. Journal of Parasitology, 91, 1143–1149. https://doi.org/10.1645/ge-516r.1
Bush, A. O., Lafferty, K. D., Lotz, J. M. y Shostak, A. W. (1997). Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al. revisited. The Journal of Parasitology, 83, 575–583.
Cole, R. A., Choudhury, A., Nico, L. G. y Griffin, K. M. (2014). Gnathostoma spinigerum in live Asian swamp eels (Monopterus spp.) from food markets and wild populations, United States. Emerging Infectious Diseases, 20, 634–642. https://doi.org/10.3201/eid2004.131566
Conagua (Comisión Nacional del Agua). (2021). Programa Hídrico Regional 2021-2024. Región Hidrológico-Administrativa XI Frontera Sur. Ciudad de México: Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Comisión Nacional del Agua.
Dias, C. A. y Perini, F. A. (2018). Biogeography and early emergence of the genus Didelphis (Didelphimorphia, Mammalia). Zoologica Scripta, 47, 645–654.
Díaz-Camacho, S. P., Delgado-Vargas, F., Willms, K., de la Cruz-Otero, M. C., Rendón-Maldonado, J. G., Robert, L. et al. (2010). Intrahepatic growth and maturation of Gnathostoma turgidum in the natural definitive opossum host, Didelphis virginiana. Parasitology International, 59, 338–343. https://doi.org/10.1016/j.parint.2010.04.004
García-Márquez, L. J., Lamothe-Argumedo, R., Osorio-Sarabia, D., García-Prieto, L. y León-Règagnon, V. (2009). Morphological and molecular identification of Gnathostoma binucleatum (Nematoda: Gnathostomatidae) advanced third stage larvae (AdvL3) in the state of Colima, Mexico. Revista Mexicana de Biodiversidad, 80, 867–870. https://doi.org/10.22201/ib.20078706e.2009.003.157
Gardner, A. L. (1973). The systematics of the genus Didelphis (Marsupialia: Didelphidae) in North and Middle America. Special Publications of the Museum Texas Tech University, 4, 1–81.
Gaspar-Navarro, J., Almeyda-Artigas, R. J., Sánchez-Miranda, E., Carranza-Calderón, L. y Mosqueda-Cabrera, M. A. (2013). Description of advanced third-stage larvae of Gnathostoma lamothei Bertoni-Ruiz et al.2005 (Nematoda: Gnathostomatidae) from experimental hosts and contributions to its life cycle. Parasitology Research, 112, 169–175. https://doi.org/10.1007/s00436-012-3122-4
Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L. y DeWaard, J. R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 270, 313–321. https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218
Hernández-Gómez, R. E., Martínez-Salazar, E. A., López-Jiménez, S. y León-Règagnon, V. (2010). Molecular identification of the advanced third-stage larvae (AdvL3) of Gnathostoma lamothei in Tabasco, Mexico. Parasitology International, 59, 97-99. https://doi.org/10.1016/j.parint.2009.10.008
Maddison, W. P. y Maddison, D. R. (2019). Mesquite: a modular system for evolutionary analysis, version 3.6. 2018.
Messing, J. (1993). M13 cloning vehicles. Their contribution to DNA sequencing. Methods in Molecular Biology, 23, 9–22. https://doi.org/10.1385/0-89603-248-5:9
Miyazaki, I. (1954). Studies on Gnathostoma ocurring in Japan (Nematoda: Gnathostomidae). II. Life history of Gnathostoma and morphological comparison of its larval forms. Kyushu Memoirs of Medical Science, 5, 123–39.
Mosqueda-Cabrera, M. Á., Sánchez-Miranda, E., Carranza-Calderón, L. y Ortiz-Nájera, H. E. (2009). Finding advanced third-stage larvae of Gnathostoma turgidum Stossich, 1902 in Mexico from natural and experimental host and contributions to the life cycle description. Parasitology Research, 104, 1219–1225. https://doi.org/10.1007/s00436-008-1318-4
Mosqueda-Cabrera, M. Á., Desentis-Pérez, D. L., Padilla-Bejarano, T. A. y García-Prieto, L. (2023). Possible zoonotic implications of the discovery of the advanced third stage larva of Gnathostoma turgidum (Spirurida: Gnathostomatidae) in a Mexican fish species. Helminthologia, 60, 112–116. https://doi.org/10.2478/helm-2023-0011
Pérez-Álvarez, Y., García-Prieto, L., Osorio-Sarabia, D., Lamothe-Argumedo, R. y León-Règanon, V. (2008). Present distribution of the genus Gnathostoma (Nematoda: Gnathostomatidae) in México. Zootaxa, 1930, 39–55. https://doi.org/10.11646/zootaxa.1930.1.3
Prosser, S. W., Velarde-Aguilar, M. G., León-Règagnon, V. y Hebert, P. D. (2013). Advancing nematode barcoding: a primer cocktail for the cytochrome c oxidase subunit I gene from vertebrate parasitic nematodes. Molecular Ecology Resources, 13, 1108–1115. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12082
Rambaut, A. (2006). Figtree. Tree figure drawing tool. Version 1.4. 2. Institute of Evolutionary Biology.
Ronquist, F., Teslenko, M., Van Der Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Höhna, S. et al. (2012). MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Systematic Biology, 61, 539–542. https://doi.org/10.1093/sysbio/sys029
